Se aloja en parte de la casa que fue habitada por San Isidro. Formando un conjunto con la Capilla de San Isidro en la Iglesia de San Andrés y la cercana Capilla del Obispo, fue el foco histórico de su culto.

El museo se compone de distintos espacios, destacando la Casa de San Isidro con el Pozo del Milagro, donde según la tradición el santo salvó a su hijo de morir ahogado y la capilla, completado por una serie de manifestaciones artísticas dedicadas a este Santo.

Dentro del edificio destaca el patio renacentista, el jardín arqueobotánico y el almacén visitable.

En el resto de sus salas se realiza un recorrido por la historia de la ciudad de Madrid desde la Prehistoria hasta que se establece la Corte.